Состоит из четырёх отделений, каждое из которых представляет собой разный тип степных ландшафтов:
«Хомутовская степь» (Новоазовский район Донецкой области, 1028 га, статус заповедника с 1926 года)
«Каменные могилы» (Володарский район Донецкой области, Куйбышевский район Запорожской области, 404 га, основан в 1927 году)
«Михайловская целина» (Лебединский район Сумской области, 202 га)
«Меловая флора» (Краснолиманский и Славянский районы Донецкой области, 1134 га, основан в 1988 году)
Заповедник был создан в 1961 году путём объединения самостоятельных заповедников «Хомутовская степь», «Каменные могилы», «Михайловская целина» и «Стрельцовская степь», которые ныне составляют его отделения, кроме «Стрельцовской степи», которая вошла в состав Луганского природного заповедника. В 1988 году было создано ещё одно отделение Украинского степного заповедника — «Меловая флора».
В заповеднике находятся под охраной 926 видов высших растений, 26 видов млекопитающих, 115 видов птиц и 10 видов рыб. 40 видов растений, произрастающих на территории заповедника занесены в Красную книгу Украины.
Общая площадь заповедника в 1976 году составляла, 1634 гектара. В 1888 году после создания «Меловой флоры» площадь увеличилась до 2756 гектаров. В 2008 году площадь заповедника увеличилась ещё на 579,6 гектара.
